Производни процес електрофорезе у полиакриламидном гелу (ПАГЕ) углавном укључује кораке као што су припрема гела, операција електрофорезе, бојење и посматрање резултата.
Припрема гела Припрема гела за одвајање (10%): Помешати 0 мл ддХ₂О, 3 мЛ 30% основног гела, 5 мЛ 5 мол/Л Трис-ХЦл, 1 мЛ 10% СДС и 1 мЛ 10% ЕД, а затим додати Т4 ЕМ 10 на дну. μЛ ТЕМЕД-а и добро промешати. Сипајте ову мешавину између стаклених плоча, затворите врх водом и сачекајте 30-60 минута да се гел потпуно полимеризује.
Припрема гела за слагање (4%): Помешати 4 мл ддХ₂О, 33 мл 30% основног гела, 25 мл 1 мол/Л Трис-ХЦл, 0,2 мл 10% СДС и 0,2 мл 10% АП, додати 2 μЛ ТЕМЕД-а и одмах добро промешати. Излијте воду на гел за одвајање, додајте ову мешавину и одмах убаците чешаљ између стаклених плоча, чекајући 15-30 минута да се гел за слагање потпуно полимеризује.
Операција електрофорезе Третман узорком: Помешајте узорак са једнаком количином 2КССДС пуфера за пуњење, загрејте на 100 степени 3-5 минута, а затим центрифугирајте на 12.000 рпм током 1 минута, и узмите супернатант за СДС-ПАГЕ анализу.
Учитавање: Узмите 10 μЛ индукованих и неиндукованих узорака и додајте их у збир узорака и додајте 20 μЛ стандарда протеина ниске молекуларне тежине као контролу.
Електрофореза: Додајте 1Кс пуфер за електрофорезу у резервоар за електрофорезу, повежите напајање, одржавајте напон гела за слагање на 60В, а напон гела за одвајање на 100В. Када бромофенол плаво достигне дно резервоара за електрофорезу, зауставите електрофорезу (око 3 сата).
Бојење и посматрање резултата
Бојење: Уклоните гел са стаклене плоче и обојите га Цоомассие Бриллиант Блуе раствором за бојење 4 до 6 сати на собној температури. Одбојавање: Ставите обојени гел у раствор за одбојавање и одбојите га неколико пута док протеинска трака не буде јасно видљива. Посматрање резултата: Након одбојавања, гел се може фотографисати и сачувати. Након што је корак одбојавања завршен, ставите гел испод система за обраду слике за фотографисање и сачувајте резултате на дискети.